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Nos principaux projets de recherche se concentrent sur la génétique et la transgenèse chez le moustique.

La génétique du moustique

Les moustiques de l’espèce Anopheles gambiae ne sont pas tous susceptibles à une infection avec les parasites du paludisme. Dans certaines lignées de moustiques, la réponse antiparasitaire est particulièrement efficace, bloquant complètement le développement du parasite à un stade précoce de l’infection (Fig. 1): ces moustiques résistants ne transmettent pas la maladie. Une question très importante est donc de comprendre pourquoi chez les moustiques,résistants, les parasites sont neutralisés, tandis que chez d’autres, au sein de la même espèce, les parasites se développent jusqu’à un stade transmissible à l’homme.

Quand nous avons commencé ce travail, la recherche de facteurs génétiques qui contrôlent la résistance se limitait à la cartographie des régions du génome contribuant à cette résistance et, plus récemment, à l’identification de gènes de résistance candidats dans ces régions. Néanmoins, même lorsque ces gènes candidats étaient polymorphes et que leur polymorphisme corrèlait avec la résistance des moustiques aux parasites du paludisme, il n’était pas possible de distinguer si la résistance était le fait du polymorphisme dans le gène identifié ou bien due au polymorphisme d’un gène de résistance situé à proximité. Pour résoudre ce problème, nous avons conçu une nouvelle approche appelée « reciprocal allele-specific RNAi » (rasRNAi) qui permet d’évaluer la contribution des différents allèles d’un même gène pour un caractère donné (Fig. 2A).

En génotypant des moustiques issus de croisements de lignées susceptible et résistante infectés par le parasite des rongeurs Plasmodium berghei  nous avons récemment démontré que les moustiques résistants et sensibles différaient dans une région importante sur le troisième chromosome appelée Pbres1 pour P. berghei résistance locus 1 (19Mo). Un des gènes situés dans Pbres1 code pour TEP1, une protéine homologue au facteur du complément C3 humain (Fig. 3), que nous avions précédemment caractérisée comme un facteur essentiel dans la réponse antiparasitaire du moustique. En utilisant la technique de rasRNAi, nous avons démontré que les polymorphismes du gène TEP1 contrôlent l’efficacité de la destruction du parasite, et avons ainsi identifié le premier gène de résistance aux parasites du paludisme chez le moustique (Fig 2B).

Figure 1. Des facteurs génétiques contrôlent la résistance aux parasites du paludisme. Des intestins de moustiques sont disséqués 8 jours après leur infection avec des parasites  P. berghei exprimant de manière constitutive la GFP. Les parasites sont visibles dans l’intestin de la lignée sensible (points verts sur la photo du haut), tandis que les intestins de moustiques résistants ne contiennent pas de parasites vivants. Dans cette lignée, les parasites tués sont enveloppés dans une capsule de mélanine (petits points noirs, photo du bas)

 

 

Figure 2. TEP1*R1 est plus efficace que TEP1*S3 pour éliminer les parasites. (A) rasRNAi. Chaque rectangle représente un gène. A l’aide d’ARN double brin courts dirigés contre TEP1*R1 (dsR) ou *S3 (dsS), l’expression de chacun des allèles de TEP1 est inhibée spécifiquement dans les moustiques de la génération F1 issus d’un croisement entre une lignée susceptible et une résistante. Ceci nous permet de comparer la fonction de chaque allèle dans le même fond génétique. (B) Nombre de parasites comptés dans la progéniture F1 du croisement L3-5 × G3 traitée avec des ARN double brin spécifiques de chaque allèle et avec dsLacZ et dsTEP1 en tant que contrôles négatif et positif, respectivement. Les moustiques exprimant seulement TEP1*S3 (dsR) ont une charge parasitaire plus importante que ceux exprimant de manière exclusive TEP1*R1 (dsS), démontrant que le polymorphisme au locus de TEP1 contribue à déterminer la résistance aux parasites du paludisme. **P < 0.001; ns, non significatif (modifié de Blandin et al., 2009).

 

 
Figure 3. Structure cristallographique de TEP1*R1 en comparaison à celle du facteur du complément C3 humain. Les différents domaines sont représentés en couleur. MG, domaine macroglobuline; LNK, linker; TED, domaine thioester ; ANK, ancre; la position du thioester (TE) est également représentée (modifié de Baxter et al., 2007)

 

 

Notre travail montre également que le polymorphisme dans TEP1 n’explique pas entièrement la variabilité observée dans la destruction des parasites, et que d’autres loci que TEP1 sont également nécessaires pour rendre compte de la résistance complète des moustiques à P. berghei dans les lignées résistantes. Notre objectif est de déchiffrer les réseaux génétiques complexes qui soutiennent la résistance des moustiques à P. berghei et P. falciparum dans des modèles d’infection de laboratoire ainsi que sur le terrain.

Grâce aux possibilités offertes par les nouvelles technologies à haut débit pour la cartographie précise des loci de caractères quantitatifs (QTL), et au rasRNAi permettant d’identifier avec précision les gènes responsables de ces caractères quantitatifs, nous effectuons un crible à haute résolution pour identifier les facteurs génétiques contrôlant la transmission du parasite chez A. gambiae, et pour comparer les réseaux génétiques qui régissent la résistance des moustiques  au parasite murin P. berghei, et au parasite humain P. falciparum.

Les gènes de résistance et les réseaux génétiques identifiés au laboratoire seront testés dans le cadre d’infections naturelles avec P. falciparum en collaboration avec le Dr Isabelle Morlais (IRD / OCEAC, Yaoundé, Cameroun). Notre objectif est d’identifier les gènes qui contribuent à la résistance à P. falciparum dans les populations naturelles et d’étudier comment nous pouvons exploiter cette résistance naturelle des moustiques aux parasites pour réduire la transmission du paludisme.


La transgenèse chez le moustique

La transgenèse chez la Drosophile a été un outil très important pour comprendre de nombreux aspects de leur biologie, en permettant notamment la surexpression de gènes d’intérêts – de manière spécifique dans des tissus, et en fonction du temps grâce au système Gal4/UAS -, la mutagenèse par l’intermédiaire d’un transposon pour la découverte de gènes clé de processus biologique donné, l’expression de protéines d’intérêt fusionnées à des marqueurs tels que la protéine fluorescente verte (GFP) pour suivre leur destin cellulaire, les manipulations génétiques fines comme KO génique, et le knockdown de gène cible par interférence ARN transgénique.

De même, la transgénèse pourrait aider à élucider les processus clés dans la biologie de l’Anophèle, notamment les interactions vecteur / Plasmodium. Ainsi, nous sommes particulièrement intéressés à exploiter la transgénèse chez l’Anophèle pour répondre aux questions que nous nous posons. Dans le futur, les moustiques transgéniques pourraient même aider à lutter contre le paludisme, la transgénèse étant potentiellement utilisable pour rendre les moustiques résistants aux parasites Plasmodium ou dans des stratégies visant à réduire les populations de moustiques vecteurs, tels que la technique de l’insecte stérile (TIS).

Nous sommes intéressés à explorer le potentiel de tous ces aspects de la transgenèse chez le moustique. Ainsi, nous avons travaillé dur pour établir la transgenèse chez A. gambiae dans notre laboratoire et nous sommes maintenant en mesure de produire des moustiques transgéniques de façon routinière. Les facteurs clés de ce succès sont l’optimisation de chaque étape de la médiation du transposon, l’établissement de solides lignées d’amarrage attP pour la transgénèse utilisant le phage PhiC31 et la construction de plasmides auxiliaires efficaces, l’utilisation du tri automatisé de de larves pour distinguer les larves de moustiques porteuses de 0, 1 ou 2 copies d’un transgène donné afin de générer rapidement des lignées homozygotes stables et de veiller à la stabilité ultérieure du transgène, et l’utilisation de plusieurs marqueurs de sélection de transgénèse pour gagner du temps en générant plusieurs lignées transgéniques distinctes simultanément.

Avec ces outils en main, nous sommes actuellement (i) en train de tester l’effet de différents transgènes lors d’une infection avec Plasmodium; (ii) d’établir la mutagénèse ciblée du génome de l’Anopheles gambiae en utilisant des endonucléases Talen synthétiques, (iii) de mettre en place des protocoles automatisés pour générer de grandes populations de moustiques porteurs de transgènes désirées ou des populations de moustiques du même sexe sans transgène. Les populations de mâles ainsi obtenues peuvent être utilisés dans la TIS ou dans des schémas d’intervention de remplacement de population visant à augmenter la fréquence des moustiques résistants aux maladies dans des populations naturelles de moustiques.

À l’avenir, nous allons continuer à explorer la façon dont la transgénèse peut aider à obtenir les moustiques mutants (mais non transgénique) incapables de transmettre la maladie. Par exemple, en apporter de légères modifications aux protéines de moustiques dont les Plasmodia ont besoin pour coloniser leur vecteur pourrait rendre le vecteur résistant aux parasites. Les transgènes utilisés pour obtenir ces modifications génétiques pourraient être ensuite éliminés par croisements génétiques et sélections, et les lignées mutantes non-transgéniques obtenues, résistantes aux maladies pourraient être utilisées dans le cadre de stratégie d’intervention visant à remplacer des populations sensibles aux parasites.

Les larves transgéniques de moustiques sont identifiées grâce à des protéines fluorescentes (cyan, vertes, jaunes ou rouges) exprimées dans le système nerveux

Nous appelons cette lignée transgénique « French kiss »

L’expression de différents marqueurs de gènes dans les larves de moustiques transgéniques permet une sélection automatisée des génotypes

Un embryon d’Anopheles gambiae prêt à être injecté (photo : J. Soichot)

CopasLe COPAS, un cytomètre en flux qui permet un tri rapide de larves transgéniques

 

Financements

Le groupe et ses membres reçoivent actuellement des financements de : INSERM, CNRS, INVESTISSEMENT d’AVENIR, ERC, ANR, INFRAVEC, FONDATION pour la RECHERCHE MEDICALE.

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